基于转录组测序和WGCNA分析挖掘黄芪三七合剂治疗IRI急性肾损伤的关键基因
模型对照组表现为广泛的肾小管坏死，肾小管间隙增宽，肾小管上皮细胞肿胀脱落坏死，炎症细胞浸润。
与模型对照组比较，黄芪三七合剂3.9g/kg组肾小管坏死明显减少，肾脏结构基本完整。
根据肾小管损伤评分分级标准，与模型对照组比较，黄芪三七合剂用药后明显降低了肾小管损伤评分。
组别 | 剂量/(g/kg) | CRE/μmol/L | BUN/mmol/L |
正常对照 | 0 | 6.8±1.5** | 14.1±1.8** |
模型对照 | 0 | 52.1±15.5 | 25.3±1.5 |
黄芪三七合剂 | 3.9 | 26.2±10.6** | 18.3±0.8** |
组别 | 剂量/(g/kg) | Il-1β/2-△△Ct | Il-6/2-△△Ct | TNF-α/2-△△Ct |
正常对照 | 0 | 1.01±0.16** | 1.14±0.71** | 1.01±0.20** |
模型对照 | 0 | 5.67±2.19 | 15.92±4.48 | 11.71±4.02 |
黄芪三七合剂 | 3.9 | 1.33±0.83** | 3.62±1.37** | 2.02±0.41** |
组别 | 剂量/(g/kg) | 样本量 | 正常 无皮质受累 (0分) | 轻度 <10%皮质受累 (1分) | 中度 10%~25%皮质受累 (2分) | 重度 26%~49%皮质受累 (3分) | 高度严重 50%~75%皮质受累 (4分) | 大面积损伤 >75%皮质受累 (5分) |
正常对照 | 0 | 6 | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
模型对照 | 0 | 6 | 0 | 0 | 1 | 2 | 1 | 2 |
黄芪三七合剂 | 3.9 | 6 | 0 | 2 | 3 | 1 | 0 | 0 |
根据DESeq2差异分析结果，将差异基因筛选条件设置为基因表达量差异倍数(FoldChange)>1.5且校正后P值(FDR)<0.05。
模型对照组较正常对照组(IRI vs Sham)共有6687个差异基因，其中信使RNA(mRNA)4668个，长链非编码RNA(lncRNA)902个，微小RNA(miRNA)12个。
黄芪三七合剂3.9g/kg组较模型对照组(AP vs IRI)共有259个差异基因，其中mRNA164个，lncRNA37个，无符合筛选条件的miRNA。
为了更好的发掘功能基因，此次差异基因筛选重点关注差异基因中的mRNA、lncRNA以及miRNA变化，由于AP vs IRI无差异miRNA变化，故仅对差异基因中mRNA和lncRNA变化进行可视化展示。
将IRI vs Sham的6687个差异基因与AP vs IRI的259个差异基因取交集，发现152个交集基因，其中mRNA103个，lncRNA21个。
按照FDR值由小到大排序，选取前10个交集mRNA和前10个交集lncRNA，绘制FPKM值热图。
并对排第1位的mRNAB细胞易位基因2(Btg2)和排第1位的lncRNAGm41361进行Real-timePCR验证，结果提示两个关键基因相对表达量趋势变化均与测序结果一致，测序结果可靠。
组别 | 剂量/(g/kg) | Btg2/2-△△Ct | Gm41361/2-△△Ct |
正常对照 | 0 | 1.01±0.18** | 1.19±0.66** |
模型对照 | 0 | 17.66±2.19 | 17.21±10.21 |
黄芪三七合剂 | 3.9 | 3.47±1.56** | 4.86±2.64* |
聚类分析结果显示，15367个基因聚类为23个模块，其中灰色模块(MEgrey)表示未聚类到任何模块的基因集合。
关联基因模块与样本表型后，绘制出模块与表型的相关性热图，其中包含279个基因的黑色模块(MEblack)与黄芪三七合剂干预治疗IRI(IRI.AP)相关系数r =-0.78，呈显著负相关( P <0.01)。
表明黑色模块是黄芪三七合剂干预治疗IRI急性肾损伤的关键模块，其中的共表达基因与黄芪三七合剂治疗IRI急性肾损伤高度相关。
绘制黑色模块中共表达基因的基因表达量与模块特征值的相关系数(MM值)与基因表达量与IRI.AP特征之间的相关性(GS值)的散点图，将MM值>0.8和GS >0.3的基因定义为该模块的核心基因，共得到84个核心基因。
然后，主要采取两种方法获取关键模块里的关键核心基因。
一是将84个黑色模块中的核心基因与黄芪三七合剂3.9g/kg组较模型对照组(AP vs IRI)差异基因取交集得到关键核心基因β-1，4-半乳糖基转移酶5(B4galt5)。
二是对84个核心基因中的蛋白编码基因进行PPI分析，结果显示该模块有34个基因有相互作用，根据Cytoscape软件中的cytoHubba插件计算最大集团中心性(maximalcliquecentrality，MCC)鉴定出关键核心基因为26S蛋白酶体泛素受体(Adrm1)、泛素1(Ubqln1)、蛋白酶体26S亚基泛素受体(Psmd4)、26S蛋白酶体(Psmc2)。
两种方法筛选出的关键核心基因的热图显示，关键核心基因B4galt5、Adrm1、Ubqln1、Psmd4、Psmc2在黄芪三七合剂3.9g/kg组较模型对照组有差异，与黄芪三七合剂干预治疗IRI急性肾损伤相关。
对关键核心基因进行Real-timePCR验证，显示B4galt5、Adrm1、Ubqln1、Psmd4、Psmc2在黄芪三七合剂干预治疗后均下调，与测序结果一致。
组别 | 剂量/(g/kg) | B4galt5/2-△△Ct | Adrm1/2-△△Ct | Ubqln1/2-△△Ct | Psmd4/2-△△Ct | Psmc2/2-△△Ct |
正常对照 | 0 | 1.09±0.53 | 1.01±0.15 | 1.04±0.31** | 1.01±0.14* | 1.05±0.33 |
模型对照 | 0 | 0.74±0.24 | 0.92±0.10 | 0.64±0.21 | 1.40±0.33 | 0.78±0.12 |
黄芪三七合剂 | 3.9 | 0.30±0.16* | 0.64±0.16** | 0.34±0.13* | 0.72±0.19** | 0.46±0.17* |
黄芪三七合剂干预治疗IRI关键特异性模块中核心基因的GO分析结果显示，该模块核心基因可显著富集(P.adjust<0.05)到3个GO分类中，各选取前5条进行展示。
在分子功能(MF)聚类中，关键核心基因Psmd4和Ubqln1与多泛素修饰依赖性蛋白结合相关，关键核心基因B4galt5与糖基转移酶活性相关。
在细胞组分(CC)聚类中，关键核心基因Psmd4和Psmc2与前4个条目，细胞质微管、蛋白酶体辅助复合物、蛋白酶体调节颗粒、蛋白酶体复合物均相关。
在生物过程(BP)聚类中，关键核心基因Psmd4与蛋白酶体介导的泛素依赖性蛋白分解代谢过程有关。
KOBAS通路富集结果显示，与黄芪三七合剂治疗IRI急性肾损伤相关的核心基因可显著富集(P.adjust<0.05)到4个数据库中的38条通路。
其中，BioCyc数据库富集到2条通路分别是靶向蛋白质降解和嘌呤与嘧啶代谢，关键核心基因Psmd4与靶向蛋白质降解相关。
PANTHER数据库富集到1条通路——泛素蛋白酶体途径，关键核心基因Psmd4与之相关。
KEGGPATHWAY数据库共富集到7条通路，其中关键核心基因Psmd4、Psmc2、Adrm1与蛋白酶体相关，B4galt5与代谢途径相关，Ubqln1与内质网中的蛋白质加工相关。
Reactome数据库共富集到28条通路，关键核心基因B4galt5与N-连接糖基化、高尔基体转运及随后的修饰相关。
B4galt5、Psmd4、Adrm1、Psmc2与蛋白质代谢、翻译后蛋白质修饰以及泛素化特异性加工蛋白酶等通路相关。
综上，筛选出的关键核心基因B4galt5、Adrm1、Ubqln1、Psmd4、Psmc2的生物学功能主要集中于胞质内蛋白糖基化修饰与蛋白酶体的相关作用。
这提示黄芪三七合剂可能通过蛋白糖基化或蛋白酶体相关代谢途径参与治疗IRI急性肾损伤。
急性肾损伤作为一种临床常见综合征，尚无特定的预防或治疗药物。
黄芪三七合剂作为临床肾病治疗的经验方，具有益气补血、健脾益肾、活血化瘀等功效，已证明其在多种肾脏疾病动物模型中具有减轻肾脏炎症，恢复肾功能等作用，对急性肾损伤具有治疗潜力。
在本研究中，我们建立了IRI急性肾损伤的小鼠模型，发现黄芪三七合剂能够显著改善IRI急性肾损伤小鼠的肾功能，降低肾脏炎症反应，但具体机制不明。
RNA-seq作为分子机制研究的重要技术手段，能够从整体分析基因表达的变化。
于是，我们以RNA-seq结果为数据基础，引入WGCNA分析，构建基因共表达网络，将庞杂的转录组测序数据按基因共表达属性和样本特征分解成共表达模块，根据相关系数选择与黄芪三七合剂干预治疗IRI急性肾损伤关联性最高的模块基因，并对关键模块基因进行深入分析，挖掘出了5个黄芪三七合剂治疗IRI急性肾损伤的关键核心基因：B4galt5、Adrm1、Ubqln1、Psmd4、Psmc2。
其中，关键核心基因B4galt5作为β1，4-半乳糖基转移酶家族中的一员，主要通过介导蛋白质糖基化参与调节细胞内的生理状态，现有研究主要发现其高表达与多种癌症的发生相关，如肝癌、乳腺癌。
在急性肾损伤中尚无相关文献报道。
但有相关研究发现在脂肪细胞中敲低B4galt5能够降低干扰素γ(IFN-γ)、TNF-α和IL-6等促炎因子的表达和M1型巨噬细胞的浸润。
这与黄芪三七合剂用药后小鼠肾脏中B4galt5表达量下调而炎症得到改善一致，提示B4galt5可能是黄芪三七合剂治疗的关键靶点。
关键核心基因Adrm1、Psmd4、Psmc2均为蛋白酶体的组成部分，Ubqln1作为泛素样蛋白能够与蛋白酶体结合，四者均与泛素-蛋白酶体系统(UPS)的相关生物学功能有关。
UPS几乎参与了肾脏病理生理的所有过程，如蛋白酶体可以通过降解IκBα(NF-κB的抑制蛋白)激活NF-κB信号，从而参与肾脏内的炎症反应。
蛋白酶体抑制剂对急性肾损伤的肾脏保护作用已有相关报道，但蛋白酶抑制剂目前仅用于临床肿瘤治疗。
进一步Real-timePCR验证发现，黄芪三七合剂干预治疗后5个关键核心基因表达量均下调。
与测序结果一致。
此外，通过对关键模块中的共表达基因进行GO和通路富集分析显示，5个关键核心基因主要参与了蛋白糖基化修饰和蛋白酶体活性抑制等生物学途径。
综上，挖掘出的5个关键核心基因均有研究潜力，是后续实验验证的主要方向。
遗憾的是，在本研究中仅从转录水平探讨了关键核心基因B4galt5、Adrm1、Psmd4、Psmc2、Ubqln1在黄芪三七合剂干预后的变化。
要确定黄芪三七合剂是否通过抑制蛋白糖基化或抑制蛋白酶体活性参与改善IRI急性肾损伤，还需要进一步完善蛋白水平的功能检测。
黄芪三七合剂可以明显降低IRI急性肾损伤小鼠模型中Il-1β、Il-6和TNF-α等炎症因子的表达，改善肾脏病理结构和肾功能，对急性肾损伤具有较好的治疗效果。
RNA-seq和WGCNA分析揭示黄芪三七合剂可能是通过靶向B4galt5、Adrm1、Ubqln1、Psmd4、Psmc2等关键核心基因，参与糖基化修饰或蛋白酶体相关代谢等途径发挥作用
