急性肾损伤是肾功能在短时间迅速下降的疾病，每年新发病例1330万

急性肾损伤(AcuteKidneyInjury，AKI)是以肾功能在短时间内迅速下降为特征的肾脏疾病。

全世界每年AKI新发病例约1330万，在我国重症监护室中，危重患者AKI发生率达到了30%～50%。

肾脏缺血再灌注(IRI)作为急性肾损伤的主要病因之一，目前并没有治疗或阻止其向慢性肾脏病或肾衰竭进展的有效手段。

而对IRI急性肾损伤及时进行干预治疗，能够有效降低患者的肾脏损害，改善甚至彻底恢复肾功能。

黄芪三七合剂是应用于临床肾病治疗的中药复方，由黄芪、三七、怀牛膝、当归、昆布5味中药组成，已有研究证明其对肾病综合征有较好的临床疗效，在部分慢性肾脏病和急性肾脏损伤动物模型中有肾保护作用。

但黄芪三七合剂如何在IRI急性肾损伤中发挥治疗作用仍待进一步研究。

RNA测序(RNA-seq)可以实现生物样本中全转录组基因表达的高通量测序，对疾病发生分子机制和药物作用机理研究提供了重要技术手段。

但是，若仅依靠RNA-seq差异分析筛选关键基因，筛选出的基因数量庞大且难以描述差异基因间的联系。

构建基因共表达网络是高效利用RNA-seq数据的重要手段，对多样本的RNA-seq数据结合加权基因共表达网络(weightedgeneco-expressionnetwork，WGCNA)分析能够将表达模式相似的基因聚类构建出共表达基因模块，再将模块与样本特征相关联，便能快速找到与研究表型关联度最高的关键模块，然后挖掘出关键模块中的核心基因。

这些核心基因便有可能是黄芪三七合剂调节特定生物表型的关键基因。

在本研究中，我们对正常对照小鼠、模型对照小鼠和黄芪三七合剂治疗的IRI小鼠的肾组织标本进行RNA-seq，并采用WGCNA分析方法解析黄芪三七合剂干预治疗IRI急性肾损伤的可能关键靶基因。

黄芪三七合剂全方包含黄芪、三七、怀牛膝、当归、昆布，成人一次用药配比为：黄芪免煎颗粒3g(批号：21090158)，怀牛膝免煎颗粒3g(批号：21070097)，当归免煎颗粒3g(批号：21060034)，昆布免煎颗粒3g(批号：21040089)，四川新绿色药业科技发展股份有限公司提供；三七粉1g(泸州百草堂中药饮片有限公司，批号：220109-4)。

剂量设置为3.9g/kg。

采用SPF级8w龄C57BL/6雄性小鼠，共27只，体质量为(20±2)g，购于成都药康生物科技有限公司，动物生产合格证号为：SCXK(川)2020-034。

动物均饲养于西南医科大学实验动物中心，环境温度和湿度适宜，12h明暗交替，环境使用许可证号：SYXK(川)2018-065)。

本研究已通过西南医科大学实验动物伦理委员会批准，审批编号为20211111-002。

DNA逆转录试剂(批号：R323-01)、荧光定量PCR染料试剂(批号：Q711-03)，南京诺唯赞生物科技有限公司；尿素氮检测试剂盒(批号：C013-2-1)、肌酐检测试剂盒(批号：C011-2-1)、HE染色试剂盒(批号：C0105)，上海碧云天生物技术有限公司。

LightCycler480II实时荧光定量PCR仪(瑞士Roche)；多功能酶标仪(美国BioTek公司)；组织切片系统(德国Leica)；全自动虚拟切片扫描系统(日本Olympus)。

采用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，置于恒温加热垫上。

背部切口暴露左侧肾蒂，使用无菌微血管夹夹闭肾脏动静脉45min(可观察到肾脏呈紫黑色)后，松开血管夹，恢复左侧肾脏血供，缝合伤口后行右侧肾脏IRI手术。

正常对照组仅暴露肾脏，不进行IRI损伤。

将27只C57BL/6小鼠适应性喂养1w后，随机分为正常对照组、模型对照组和黄芪三七合剂3.9g/kg组，每组9只小鼠，黄芪三七合剂3.9g/kg组小鼠术前30min灌胃给药按照8mL/kg给药，正常对照组和模型对照组给予相应体积的生理盐水，术后连续灌胃3d后处死动物，1%戊巴比妥钠麻醉小鼠后，心脏采血，血液样本放置于4℃过夜后收集血清用于肌酐、尿素氮的测定；肾脏去除包膜后用4%多聚甲醛固定部分组织，用于石蜡包埋，剩余组织冻于-80℃用于RNA提取。

每组随机挑选3只用于转录组测序。

石蜡组织切成4μm切片，经脱蜡和复水后，按照试剂盒说明书进行HE染色。

中性树胶封片后，显微镜下观察。

在200×镜下，每张切片在皮质随机选取10个不重复视野，观察有无细胞变形坏死、肾小管扩张、管型沉积、刷状缘缺失或坏死，病变按0到5分分级：0分为正常；1分为不到10%的皮质受累；2分为10%到25%的皮质受累；3分为25%至50%的皮质受累；4分为50%-75%的皮质受累；5分为超过75%的皮质受累。

采用Trizol法提取总RNA，测量RNA浓度和纯度后，取1μgRNA逆转录为cDNA，采用基于SYBR染料的real-timePCR法检测指定基因表达水平。

PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，共40个循环。

PCR结果分析是以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算各组相对于正常对照组的相对表达量。

本文所使用的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

RNA测序(RNA-seq)由北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行。

原始数据的质量控制和比对定量由公司完成，最终得到多个样本数值化基因表达数据(readcount)矩阵。

根据获得的数值化基因表达数据矩阵，去除表达量为0的比例大于50%的基因，使用R软件包DESeq2进行差异分析，BH法对P值进行矫正，以FoldChange>1.5和FDR<0.05为条件筛选模型对照组较正常对照组和黄芪三七合剂3.9g/kg组较模型对照组的差异表达基因。

采用ggplot2包对差异表达结果进行可视化展示。

在R(R版本4.2.2)中将基因表达矩阵转换为基因FPKM矩阵，根据Ensembl108版本小鼠数据库对基因进行注释，选取其中的蛋白编码基因(protein_coding)、非编码基因(lncRNA和miRNA)，使用WGCNA包进行分析。

为了使WGCNA结果更可靠(样本数量≥15)，将课题组同一批转录测序的另6只小鼠肾脏样本(包括3只单侧输尿管结扎小鼠和3只黄芪三七合剂干预单侧输尿管结扎小鼠)共同纳入分析。

WGCNA分析过程按照WGCNA作者提供流程进行。

主要分析流程为输入数据，检测数据完整度，确定软阈值，建立邻接矩阵和拓扑矩阵。

其中的关键步骤为根据获得的拓扑矩阵使用相异度聚类，采用动态剪切法将基因划分为不同的共表达模块，合并相似性大于75%的模块，每个模块至少含有30个基因。

为了鉴定出与黄芪三七合剂治疗IRI急性肾损伤高度相关的模块，将表型文件中样本做过IRI手术定义为1，未行手术定义为0，接受黄芪三七合剂治疗定义为1，未接受治疗定义为0。

重点关注黄芪三七合剂干预治疗IRI的样本(IRI.AP)，将其与上一步获得的共表达模块进行相关性分析，得到相关系数最高的关键模块。

通过计算基因表达量与模块特征值的相关系数，即MM值，以及基因表达量与IRI.AP特征之间的相关性，即GS值。

绘制关键模块基因MM值绝对值与GS值绝对值散点图，将MM值绝对值大于0.8，GS值绝对值大于0.3的基因确定为该模块的核心基因。

主要采取两种方法获取关键模块里的关键核心基因。

将模块核心基因与差异基因取交集，挖掘出关键模块中表达量变化较大的关键核心基因。

基于STRING数据库对关键模块的核心基因进行蛋白质互作网络(PPI)分析，构建互作网络图。

利用Cytoscape软件中cytoHubba插件计算最大集团中心度(MCC)，对互作网络中的节点进行排序，从而筛选出其中的关键节点作为关键核心基因。

将两种方法获取的关键核心基因使用R中pheatmap包绘制出FPKM表达量热图，并进行Real-timePCR验证。

使用R语言中的clusterProfiler包结合在线工具KOBAS对关键模块的核心基因进行GO分析和多数据库的通路富集分析，主要包括KEGGPATHWAY、Reactome、PANTHER、BioCyc等数据库通路富集结果。

筛选条件为矫正后P值( P.adjust)<0.05。

定量数据采用均数±标准差(`x±s )表示。

使用SPSS26.0软件进行ANOVA单因素方差分析，采用LSD方法进行组间比较。

P <0.05被认为具有统计学意义。

造模和灌胃实验过程中，有小鼠因操作原因出现死亡，故采用随机数字表法各组随机选取6只进行治疗效果评估。

肾功能检测是评估IRI急性肾损伤严重程度的重要指标，与正常对照组相比，模型对照组血肌酐、尿素氮明显升高(P <0.01)；与模型对照组相比，黄芪三七合剂干预显著降低了IRI急性肾损伤小鼠血清肌酐、尿素氮含量( P <0.01)。

Real-timePCR结果也显示，与模型对照组相比，黄芪三七合剂干预后明显降低了IRI急性肾损伤小鼠体内Il-1β、Il-6和TNF-α等炎症因子mRNA的表达( P <0.01)。

同样，HE染色结果显示，正常对照组肾脏皮质结构清晰，肾小管无扩张，无管型沉积，刷状缘无缺失及坏死。