编译：微科盟 梅子，编辑：微科盟 景行、江舜尧。
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导读
新烟碱是一种广泛使用但对环境有害的杀虫剂。人工湿地具有去除新烟碱的潜力，但人们对湿地植物中相应的代谢途径和机制了解甚少。本研究通过酶学和转录组学分析，研究了六种新烟碱及其代谢物在常见湿地植物纸莎草（Cyperus papyrus）中的去向以及潜在的代谢机制。研究发现，新烟碱类物质被植物根部吸收并向上转移，导致芽中的新烟碱类物质含量较高。新烟碱及其代谢物的浓度在接触后的第28天降至最低。硝基还原、羟基化和脱甲基化是纸莎草对新烟碱的主要代谢反应。这些反应可能是由细胞色素P450酶、醛氧化酶、谷胱甘肽-二硫化物还原酶和葡萄糖醛酸还原酶介导的。研究者根据过氧化物酶和过氧化氢酶的酶活性评估了新烟碱对纸莎草的毒性。转录组分析表明，差异表达基因（DEGs）主要编码与免疫过程和细胞生长调节有关的蛋白质。DEGs的共表达相关性分析表明，编码P450s、过氧化物酶和谷胱甘肽S转移酶的基因是关键的功能基因。本研究阐明了新烟碱类化合物在湿地植物中的应激反应和降解机制，为构建湿地中有机污染物的植物修复提供了新的见解。
论文ID
原名：Phytodegradation of neonicotinoids in Cyperus papyrus from enzymatic and transcriptomic perspectives
译名：从酶和转录组的角度看纸莎草对新烟碱的植物降解作用
期刊：Journal of Hazardous Materials
IF：13.6
发表时间：2023年10月
通讯作者：杨扬，Xiaoyan Tang
通讯作者单位：暨南大学
DOI号：10.1016/j.jhazmat.2023.132715
实验设计
结果
1 纸莎草对新烟碱的吸收、积累和转移
研究者发现，溶液样品中六种新烟碱的浓度随着暴露时间的延长而逐渐下降（图1）。28天暴露实验结束时，所有目标新烟碱类物质的去除率都相对较高，去除率分别为55.51±0.98%（DIN）、73.23±1.55%（CLO）、79.19±6.06%（THX）、81.34±1.11%（IMI）、88.68±2.37%（ACE）和97.73±0.38%（THA）。在整个接触期间，根和芽中都检测到了新烟碱，第一周根中的新烟碱浓度相对较高（1.04-13.16μg/g，干重），随后有所下降。与此类似，以前对防晒化合物羟苯酮在纸莎草中的去向进行的研究也发现，植物吸收大部分是在很短的时间内转移的。根中IMI的下降与溶液样本之间的变化相对一致，这与植物对新烟碱的被动迁移有关。芽中新烟碱类物质的存在表明存在一定程度的富集，这表明这些杀虫剂被根系快速吸收，然后转运到纸莎草的芽中。不过，芽富集度并没有随着暴露时间的延长而呈上升趋势。之前的一项研究也证明，新烟碱类杀虫剂并没有从芽大量转移到根部。转运具有化合物特异性，DIN、IMI和THX的易位因子（TF）高于其他三种新烟碱类杀虫剂（表S4），表明前三种杀虫剂更容易向上转运。这可能是由于它们的分子量较低，水溶性较高。植物中新烟碱类杀虫剂的总体浓度（根部和芽组织的总和）随着时间的推移呈下降趋势。在接触期结束时，植物中的新烟碱类浓度达到最低值，为0.013-0.119 μg/g鲜重。这与药物和个人护理产品（如卡马西平、双氯芬酸和阿替洛尔）的结果形成鲜明对比，因为在35天的暴露期中，这些污染物在植物部分的浓度有所增加。与哺乳动物处理异种生物的方式不同，植物可以直接将异种生物储存在液泡中，或将异种生物代谢为低分子质量的物质。研究者观察到的组织浓度下降表明，除了新烟碱的吸收和转运外，这还与纸莎草中新烟碱的代谢有关。
图1.暴露28天期间，六种新烟碱：（a）吡虫啉（IMI）、（b）啶虫脒（ACE）、（c）噻虫啉（THA）、（d）噻虫胺（CLO）、（e）呋虫胺（DIN）和（f）噻虫嗪（THX）在溶液样本中的消散情况及其在纸莎草组织（根和芽）中的累积情况。数据为平均浓度（干重）±标准误值（n=3）。
2 纸莎草对新烟碱的代谢与转化
吡虫啉（IMI）在植物体内的代谢包括以下三种主要的生物转化途径。（i）IMI的咪唑烷环上的乙烯桥羟基化作用会形成羟基代谢物，随后脱水形成烯烃化合物。（ii）IMI-脲可通过硝基还原形成。环胍失去NO基团后，硝基还原形成亚硝胺化合物，最终产生脲代谢物。（iii）IMI-olefin和IMI-urea的C-N键裂解形成6-CNA。在本研究中，根和芽中都检测到了5-OH-IMI、IMI-烯烃、IMI-脲和6-CNA（图2），表明纸莎草中的IMI代谢遵循这三种主要的生物转化途径（图3a）。这四种代谢物在根中的浓度随着暴露时间的延长而逐渐下降，但在芽中的浓度则逐渐增加，并在第21天达到峰值。以前的研究表明，IMI-脲是土壤中微生物降解形成的主要代谢物，而IMI-烯烃通常由植物降解形成。同样，在本研究中，IMI-烯烃也是最主要的代谢物，其次是5-OH-IMI。
研究者表征了啶虫脒（ACE）的两种代谢物，包括由ACE氧化N-脱烷基形成的ACE-N和由ACE氧化裂解生成的6-CNA（图3f）。在整个接触期间，ACE-N的浓度都高于6-CNA的浓度（图2），这表明ACE的去甲基化是纸莎草中主要的相关代谢反应。虽然6-CNA是IMI和ACE的代谢产物，但由于其不稳定性，其浓度很低，甚至低于检测限。此外，6-CNA很容易分解成CO2和H2O。以前曾报道过噻虫啉（THA）的三种代谢途径：（1）还原为噻虫啉-酰胺；（2）羟基化为4-OH-THA，然后脱氰；（3）直接氧化。本研究中发现的唯一代谢物是THA-酰胺（图2），表明还原THA是主要的代谢途径（图3b）。
图2.在28天的接触期间，六种新烟碱：（a）吡虫啉（IMI）、（b）啶虫脒（ACE）、（c）噻虫啉（THA）、（d）噻虫胺（CLO）、（e）呋虫胺（DIN）和（f）噻虫嗪（THX）在纸莎草组织（根和芽）中产生的代谢物浓度的变化。数据为平均浓度（干重）±标准误值（n=3）。
噻虫胺（CLO）通过氧化脱甲基代谢为CLO-DE（图3d）。根据CLO-DE的形成确定CLO已发生代谢。然而，在接触28天后，植物体内的CLO-DE浓度降至很低的水平（根0.040 μg/g，芽0.036 μg/g，干重）（图2），这与液相中CLO-DE的逐渐增加形成鲜明对比（图S2）。对呋虫胺（DIN）的代谢途径包括N-脱甲基化、N-亚甲基羟基化、四氢呋喃羟基化、胺裂解和硝基还原。本研究中发现的唯一代谢物是DIN-UF，表明DIN的硝基还原是主要的代谢途径（图3c）。噻虫嗪（THX）产生两组代谢物，一组具有完整的恶二嗪环，如THX-去甲基（THX-DE），另一组具有开环的CLO及其衍生物（CLO-DE）（图3e）。在芽和根中，CLO的浓度远高于THX-DE和CLO-DE（图2）。之前的研究也表明，CLO是THX在菠菜中的主要代谢产物。
因此，在本研究中，六种新烟碱类化合物在纸莎草中的代谢过程中发生了多种反应，包括羟基化、硝基还原、脱氢、去甲基化和脱饱和（图3）。根据中间产物的浓度和相应的代谢途径，脱甲基、硝基还原和羟基化是主要的反应。在接触过程中，纸莎草的根和芽中的代谢物都有积累，在第14天至第21天出现浓度峰值。不过，到第28天，植物组织中的新烟碱及其代谢物浓度降至观察到的最低水平。这意味着纸莎草不仅能降解新烟碱，还能进一步代谢其中间代谢物，以避免这些代谢物的毒性作用。一般来说，除THA-amide外，新烟碱类代谢物在芽（气生部分）中的含量明显高于根（地下部分）。芽中代谢物浓度较高的原因可能是代谢物的亲水性较强，分子量较小，这有利于它们转移到气生部分。芽被认为是新烟碱类化合物积累和代谢的主要区域，芽中酶的高活性可显著促进植物体内异种生物的代谢。从图2可以看出，与其他新烟碱类杀虫剂相比，THA代谢物THA-amid在根和茎中的浓度相对较高。相比之下，DIN代谢物DIN-UF在茎叶中的积累浓度相对较低。纸莎草中每种新烟碱类化合物的代谢途径和代谢产物都不相同，这可能受到每种化合物的结构和植物代谢机制的影响。
图3.根据定量代谢物和文献信息推断的六种新烟碱（a）吡虫啉（IMI）、（b）噻虫啉（THA）、（c）呋虫胺（DIN）和、（d）噻虫胺（CLO）、（e）噻虫嗪（THX）和（f）啶虫脒（ACE）在纸莎草中的降解代谢途径。
3 纸莎草对新烟碱的解毒与代谢
3.1 与新烟碱类代谢相关的酶促反应
作为参与植物解毒I期和II期的主要酶，P450、AOX、GAR和GSR在异生物和内源化合物的解毒过程中具有突出的潜在作用。为了弄清新烟碱类化合物代谢的酶学机制，研究者测定了纸莎草芽和根中P450、AOX、GAR和GSR在暴露28天内不同时间点的酶活性（图S3、图S4）。纸莎草根和芽中的GSR活性最高（38.96-88.21U/L），P450（10.86-40.44U/L）、AOX（11.56-40.38U/L）和GAR（10.43-30.36U/L）最低。在六种不同的新烟碱类药物作用下，根和芽中四种酶的变化趋势各不相同。然而，酶活性的变化似乎与某些新烟碱类代谢物的出现有关。为了探索这些酶在新烟碱代谢中的特异性，研究者推断了酶活性与代谢物浓度之间的关系（图4）。
在吡虫啉暴露组中，芽和根中的GAR活性与6-CNA浓度呈显著负相关，而AOX活性与芽中的IMI-olefin（p＜0.05）和5-OH-IMI（p＜0.01）浓度呈显著负相关。此外，芽中的GSR活性与IMI-olefin浓度呈负相关。在啶虫脒暴露组中，芽中的GAR活性和根中的GSR活性分别与ACE-N和6-CNA的浓度呈极显著的正相关。相反，根中的GAR活性和芽中的P450活性与6-CNA浓度呈显著负相关。芽和根中的AOX活性与ACE-N浓度呈显著正相关。在噻虫啉暴露组中，观察到GSR活性与THA-amide浓度之间存在高度正相关，而芽和根中的AOX活性与THA-amide浓度之间存在明显的负相关。此外，芽中的P450活性与THA-amide浓度呈显著正相关。CLO-DE的浓度与P450和AOX活性呈显著正相关。根中的P450活性和芽中的GSR活性与DIN-UF浓度呈显著负相关。然而，根中的AOX活性与DIN-UF浓度的相关性与芽中的相反。在噻虫嗪暴露组中，根中的P450活性与CLO和THX-DE浓度之间呈显著负相关，而根中的GSR活性与CLO浓度之间以及芽中的AOX活性与THX-DE浓度之间呈显著正相关。同样，芽和根中GAR活性与CLO浓度的相关性表现出相反的迹象。这种现象可能是由于芽中的代谢物浓度高于根中的代谢物浓度，这对纸莎草的生理产生了不利影响，从而减少了GAR的产生。
如果酶的活性与代谢物的浓度呈正相关，则表明该酶可能在代谢物的生成过程中发挥作用；如果呈负相关，则表明该酶可能参与了代谢物的代谢过程。因此，研究结果表明，P450可能参与了ACE和CLO的去甲基化以及THA的氧化反应，从而生成THA-酰胺。此外，THA的氧化反应似乎也会产生THA-酰胺，这可能与P450有关。先前的研究表明，在第一阶段，细胞色素P450成员作为最大的酶蛋白家族，负责通过羟基化、去甲基化、去饱和化、还原、环氧化或异构化等方式降解杀虫剂，这与本研究结果一致。同样，AOX与ACE、CLO和THX的去甲基化有关，而GAR可能有助于从ACE生成6-CNA和ACE-N。GSR显示可能参与了从ACE生成6-CNA和从THX生成CLO的过程。值得注意的是，虽然本研究根据明显的相关性（图4）有力地表明了这些酶与各种新烟碱类代谢物之间的联系，但在后续研究中，有必要进行直接实验验证，以确认它们在代谢物生成中的具体作用。
图4.纸莎草芽（a）和根（b）中酶活性与代谢物浓度之间相关性的热图（皮尔逊相关系数）。每幅图的颜色表示酶活性与代谢物浓度之间的相关性。紫红色表示高度正相关，蓝色表示高度负相关。每幅图中的数字为相关系数（r），括号内为显著性（p）（*，p＜0.05；**，p＜0.01）。
3.2 新烟碱类暴露对纸莎草纸生化特性的影响
研究者发现，暴露第3天，纸莎草芽和根部的CAT活性受到抑制，这表明新烟碱类药物的浓度可能对植物造成了广泛的氧化损伤（图S5、图S6）。这与暴露初期纸莎草生物量下降的情况一致。随着实验期间植物的持续生长，新烟碱处理中的CAT活性水平有所提高。另一方面，THA和DIN处理组在第3天时，芽中的POD活性（图S7）增加，而根中的POD活性（图S8）降低。酶活性的差异可能与植物组织中新烟碱的浓度和类型有关。这些酶活性的增加以及正常的生长表明，CAT和POD能有效清除ROS，防止植物细胞因新烟碱胁迫而受到氧化损伤。在新烟碱处理的初始阶段之后，纸莎草的生物量逐渐增加，这可能是由氧化应激介导的激素效应引起的。过量施用新烟碱会对植物生长的各个方面产生不利影响，如呼吸作用、光合作用、细胞生长和生物合成。本研究表明，纸莎草在接触新烟碱时具有很强的抗逆性，可以通过增强抗氧化酶的活性来消除新烟碱造成的氧化应激，在吸收和积累过程中继续正常生长，并利用各种代谢酶将植物组织中的新烟碱代谢掉。
4 通过转录组测序揭示的对新烟碱类物质的分子反应
4.1 DEGs对新烟碱处理的响应
为了确定新烟碱类化合物在纸莎草中代谢和解毒的分子机制，研究者对根部进行了转录组学分析。通过对比新烟碱处理组和对照组，研究者在12501个差异表达基因（DEGs）中发现了6721个特异的DEGs（图5a）。前20个显著上调的基因主要与蛋白质的生物合成、延伸因子和核糖体蛋白、抗氧化防御、脱氢酶、氧化还原酶、异种生物降解和ABC转运体有关（表S6）。mRNA的翻译阶段需要大量能量和许多延伸因子，核糖体蛋白（如60S和40S核糖体蛋白）参与蛋白质的生物合成。在新烟碱处理下，编码氧化应激反应蛋白（如热休克蛋白和金属硫蛋白）的基因显著上调（表S6）。热休克蛋白不仅可以作为分子伴侣促进正确折叠，防止变性蛋白质在各种应激因子作用下积累，还在各种生理和生物过程中发挥重要作用。
4.2 参与新烟碱代谢的DEGs的关键GO术语和KEGG通路
基因本体（GO）富集分析表明，所有受调控的DEGs主要富集于一些与氧化应激反应有关的关键术语，如过氧化物酶活性、活性氧代谢过程、过氧化氢分解过程、过氧化氢代谢过程和以过氧化物为受体的氧化还原酶活性（图5c）。与植物激素有关的术语也得到了富集，包括细胞分裂素生物合成过程、细胞分裂素代谢过程、细胞激素代谢过程和激素生物合成过程等。众所周知，细胞分裂素是一种重要的植物激素，可控制细胞分裂、植物生长、开花、延迟叶片衰老、调节非生物和生物胁迫等多种过程。基于KEGG通路的代谢过程分析（图5b）显示，所有受调控的DEGs都主要富集在二苯乙烯类、二芳基庚烷类和姜酚的生物合成、苯丙类化合物的生物合成、黄酮类化合物的生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、植物激素信号转导和谷胱甘肽代谢中。这些途径大多与氧化应激和异生物代谢有关。苯丙酮和类黄酮在植物防御生物和非生物刺激的过程中起着物理/化学屏障的作用。在六种新烟碱处理中，这些生物合成途径的DEGs都有显著上调（图S9），这表明纸莎草能合成更多的次生代谢物来促进新烟碱的代谢。此外，在植物激素信号转导途径和MAPK信号转导途径中也富集了显著上调的DEGs。这是应激反应中介导细胞增殖、分化和凋亡的两个关键信号通路。
图5.（a）暴露于六种不同新烟碱诱导的纸莎草中下调和上调的差异表达基因（DEGs）数量，DEGs的定义为折合变化≥2或≤-2，且经错误发现率（FDR）调整后的p值＜0.05。（b）京都基因和基因组百科全书（KEGG）对暴露于六种不同新烟碱处理的纸莎草中常见DEGs的富集途径分析。气泡图显示了前20个KEGG富集通路。气泡图的x轴表示富集得分。气泡越大，表明涉及的差异表达单基因越多。气泡的颜色表示FDR，如图例所示。（c）暴露于六种不同新烟碱处理的纸莎草中常见DEGs的基因本体（GO）富集分析。GO术语沿y轴排列。上方的x轴表示每个GO术语的单基因数量，下方的x轴表示富集的FDR水平。FDR越小，-log10（FDR）值越大，GO项的富集程度越显著。显示的是富集程度最高的20个GO项（p-adjust＜0.5）。（d）韦恩图显示了六种新烟碱处理中特异和共享DEGs的数量。
4.3 新烟碱类物质代谢的关键DEGs的鉴定
研究者对观察到的代谢DEGs进行了网络分析，以确定参与新烟碱代谢的主要基因。DEGs的WGCNA包括编码P450、AOX、GAR、GSR、POD和CAT等主要酶的基因，而且在所有六种新烟碱处理中，涉及关键KEGG通路的基因都出现了上调。这些基因包括苯丙酮生物合成、类黄酮生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、谷胱甘肽代谢、植物激素信号转导和MAPK信号通路。通过相关性分析，WGCNA发现了10个模块，图6和图S10以不同颜色显示了各新烟碱处理的结果。三个模块的模块-性状关系（MTR）大于0.8，被选为进一步分析枢纽基因的代表模块（图6）。在三个关键模块中，大多数基因参与了P450、POD和谷胱甘肽S-转移酶（GST）的编码。三个模块中的关键基因是根据cytoHubba插件中的七种算法计算得出的。结果发现编码POD_60、POD_2、POD_17、CYP72A219、PG和肌动蛋白克隆403的基因属于绿松石模块。同时，编码POD_1、NADPH-CYP450、POD_16、CYP45090B1和CHS1的基因是黄色模块中的关键基因。此外，粉红色模块中的关键基因编码PODP7。这些发现表明，在这三个模块中检测到的关键基因可能驱动了新烟碱类化合物的代谢，表明它们可能被用作植物降解新烟碱类化合物的关键功能基因。
图6.最相关模块的基因共表达网络分析（r＞0.8，p＜0.01）。（a）关联度最高的粉色模块中的基因网络。（b）关联度最高的黄色模块中的基因网络。（c）相关度最高的绿松石模块中的基因网络。节点（即基因枢纽）的大小和颜色根据MCC方法的得分程度缩放，每条边的长度根据权重计算。红色标记表示关键中心基因。CytoHubba包含七种不同的计算核心基因的算法，即MCC、DMNC、MNC、Degree、EPC、BottlNneck、Eccentricity和Closeness。关键枢纽基因的确定基于在至少七种不同算法中得分排名前30%的枢纽基因的交叉点。
结论
纸莎草能够吸收、运输和降解新烟碱。新烟碱及其代谢物的浓度不断下降，在28天的暴露期结束时达到较低水平。硝基还原、羟基化和脱甲基化是纸莎草对新烟碱响应的主要代谢反应。这些代谢反应可能由P450、AOX、GSR和GAR等代谢酶介导。转录组分析和基因网络分析显示，编码P450、POD和GST的基因主要参与纸莎草对新烟碱类化合物的代谢响应。这些发现对于在补救工作中推广和利用湿地植物具有重要意义。
