热图绘制

热图是做分析时常用的展示方式，简单、直观、清晰。可以用来显示基因在不同样品中表达的高低、表观修饰水平的高低等。任何一个数值矩阵都可以通过合适的方式用热图展示。

本篇使用R的ggplot2包实现从原始数据读入到热图输出的过程，并在教程结束后提供一份封装好的命令行绘图工具，只需要提供矩阵，即可一键绘图。

上一篇讲述了Rstudio的使用作为R写作和编译环境的入门，后面的命令都可以拷贝到Rstudio中运行，或写成一个R脚本，使用Rscript heatmap.r运行。我们还提供了Bash的封装，在不修改R脚本的情况下，改变参数绘制出不同的图形。

生成测试数据

绘图首先需要数据。通过生成一堆的向量，转换为矩阵，得到想要的数据。

data <- c(1:6,6:1,6:1,1:6, (6:1)/10,(1:6)/10,(1:6)/10,(6:1)/10,1:6,6:1,6:1,1:6, 6:1,1:6,1:6,6:1)

 [1] 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 1.0
[20] 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.1 0.2
[39] 0.3 0.4 0.5 0.6 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 6.0 5.0 4.0
[58] 3.0 2.0 1.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 6.0 5.0 4.0 3.0
[77] 2.0 1.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0
[96] 1.0

注意：运算符的优先级。

> 1:3+4
[1] 5 6 7
> (1:3)+4
[1] 5 6 7
> 1:(3+4)
[1] 1 2 3 4 5 6 7

Vector转为矩阵 (matrix)，再转为数据框 (data.frame)。

# ncol: 指定列数
# byrow: 先按行填充数据
# ?matrix 可查看函数的使用方法
# as.data.frame的as系列是转换用的
data <- as.data.frame(matrix(data, ncol=12, byrow=T))

V1  V2  V3  V4  V5  V6  V7  V8  V9 V10 V11 V12
1 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0
2 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0
3 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
4 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0
6 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0
7 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0
8 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0

# 增加列的名字
colnames(data) <- c("Zygote","2_cell","4_cell","8_cell","Morula","ICM","ESC","4 week PGC","7 week PGC","10 week PGC","17 week PGC", "OOcyte")
# 增加行的名字
# 注意paste和paste0的使用
rownames(data) <- paste("Gene", 1:8, sep="_")
# 只显示前6行和前4列
head(data)[,1:4]

    Zygote 2_cell 4_cell 8_cell
Gene_1    1.0    2.0    3.0    4.0
Gene_2    6.0    5.0    4.0    3.0
Gene_3    0.6    0.5    0.4    0.3
Gene_4    0.1    0.2    0.3    0.4
Gene_5    1.0    2.0    3.0    4.0
Gene_6    6.0    5.0    4.0    3.0

虽然方法比较繁琐，但一个数值矩阵已经获得了。

还有另外2种获取数值矩阵的方式。

• 读入字符串

# 使用字符串的好处是不需要额外提供文件
# 简单测试时可使用，写起来不繁琐，又方便重复
# 尤其适用于在线提问时作为测试案例
> txt <- "ID;Zygote;2_cell;4_cell;8_cell
+ Gene_1;1;2;3;4
+ Gene_2;6;5;4;5
+ Gene_3;0.6;0.5;0.4;0.4"
# 习惯设置quote为空，避免部分基因名字或注释中存在引号，导致读入文件错误。
# 具体错误可查看 http://blog.genesino.com/collections/R_tips/ 中的记录
> data2 <- read.table(text=txt,sep=";", header=T, row.names=1, quote="")
> head(data2)
       Zygote X2_cell X4_cell X8_cell
Gene_1    1.0     2.0     3.0     4.0
Gene_2    6.0     5.0     4.0     5.0
Gene_3    0.6     0.5     0.4     0.4

可以看到列名字中以数字开头的列都加了X。一般要尽量避免行或列名字以数字开头，会给后续分析带去一些困难；另外名字中出现的非字母、数字、下划线、点的字符都会被转为点，也需要注意，尽量只用字母、下划线和数字。

# 读入时，增加一个参数`check.names=F`也可以解决问题。
# 这次数字前没有再加 X 了
> data2 <- read.table(text=txt,sep=";", header=T, row.names=1, quote="", check.names = F)
> head(data2)
       Zygote 2_cell 4_cell 8_cell
Gene_1    1.0    2.0    3.0    4.0
Gene_2    6.0    5.0    4.0    5.0
Gene_3    0.6    0.5    0.4    0.4

• 读入文件

与上一步类似，只是改为文件名，不再赘述。

> data2 <- read.table("filename",sep=";", header=T, row.names=1, quote="")

转换数据格式

数据读入后，还需要一步格式转换。在使用ggplot2作图时，有一种长表格模式是最为常用的，尤其是数据不规则时，更应该使用 （这点，我们在讲解箱线图时再说）。

# 如果包没有安装，运行下面一句，安装包
#install.packages(c("reshape2","ggplot2"))
library(reshape2)
library(ggplot2)
# 转换前，先增加一列ID列，保存行名字
data$ID <- rownames(data)
# melt：把正常矩阵转换为长表格模式的函数。工作原理是把全部的非id列的数值列转为1列，命名为value；所有字符列转为variable列。
# id.vars 列用于指定哪些列为id列；这些列不会被merge，会保留为完整一列。
data_m <- melt(data, id.vars=c("ID"))
head(data_m)

    ID    variable value
1  Gene_1      Zygote   1.0
2  Gene_2      Zygote   6.0
3  Gene_3      Zygote   0.6
4  Gene_4      Zygote   0.1
5  Gene_5      Zygote   1.0
6  Gene_6      Zygote   6.0
7  Gene_7      Zygote   6.0
8  Gene_8      Zygote   1.0
9  Gene_1      2_cell   2.0
10 Gene_2      2_cell   5.0
11 Gene_3      2_cell   0.5
12 Gene_4      2_cell   0.2
13 Gene_5      2_cell   2.0
14 Gene_6      2_cell   5.0
15 Gene_7      2_cell   5.0
16 Gene_8      2_cell   2.0

分解绘图

数据转换后就可以画图了，分解命令如下：

# data_m: 是前面费了九牛二虎之力得到的数据表
# aes: aesthetic的缩写，一般指定整体的X轴、Y轴、颜色、形状、大小等。
#      在最开始读入数据时，一般只指定x和y，其它后续指定
p <- ggplot(data_m, aes(x=variable,y=ID)) 
# 热图就是一堆方块根据其值赋予不同的颜色，所以这里使用fill=value, 用数值做填充色。
p <- p + geom_tile(aes(fill=value)) 
# ggplot2为图层绘制，一层层添加，存储在p中，在输出p的内容时才会出图。
p
## 如果你没有使用Rstudio或其它R图形版工具，而是在远程登录的服务器上运行的交互式R，需要输入下面的语句，获得输出图形 （图形存储于R的工作目录下的Rplots.pdf文件中）。
## 如何指定输出，后面会讲到。
#dev.off()

热图出来了，但有点不对劲，横轴重叠一起了。一个办法是调整图像的宽度，另一个是旋转横轴标记。

# theme: 是处理图美观的一个函数，可以调整横纵轴label的选择、图例的位置等。
# 这里选择X轴标签45度。
# hjust和vjust调整标签的相对位置，具体见 <https://stackoverflow.com/questions/7263849/what-do-hjust-and-vjust-do-when-making-a-plot-using-ggplot>。
# 简单说，hjust是水平的对齐方式，0为左，1为右，0.5居中，0-1之间可以取任意值。vjust是垂直对齐方式，0底对齐，1为顶对齐，0.5居中，0-1之间可以取任意值。
p <- p + theme(axis.text.x=element_text(angle=45,hjust=1, vjust=1))
p

设置想要的颜色。

# 连续的数字，指定最小数值代表的颜色和最大数值赋予的颜色
# 注意fill和color的区别，fill是填充，color只针对边缘
p <- p + scale_fill_gradient(low = "white", high = "red")
p

调整legend的位置。

# postion可以接受的值有 top, bottom, left, right, 和一个坐标 c(0.05,0.8) (左上角，坐标是相对于图的左下角计算的）
p <- p + theme(legend.position="top")

调整背景和背景格线以及X轴、Y轴的标题。(注意灰色的背景没了)

p <- p + xlab("samples") + theme_bw() + theme(panel.grid.major = element_blank()) + theme(legend.key=element_blank())
p

合并以上命令，就得到了下面这个看似复杂的绘图命令。

p <- ggplot(data_m, aes(x=variable,y=ID)) + xlab("samples") + theme_bw() + theme(panel.grid.major = element_blank()) + theme(legend.key=element_blank())  + theme(axis.text.x=element_text(angle=45,hjust=1, vjust=1)) + theme(legend.position="top") +  geom_tile(aes(fill=value)) + scale_fill_gradient(low = "white", high = "red")

图形存储

图形出来了，就得考虑存储了，

# 可以跟输出文件不同的后缀，以获得不同的输出格式
# colormode支持srgb （屏幕）和cmyk （打印，部分杂志需要，看上去有点褪色的感觉）格式
ggsave(p, filename="heatmap.pdf", width=10,
        height=15, units=c("cm"),colormodel="srgb")

至此，完成了简单的heatmap的绘图。但实际绘制时，经常会碰到由于数值变化很大，导致颜色过于集中，使得图的可读性下降很多。因此需要对数据进行一些处理，具体的下次再说。